肝豆状核变性——肝脏中的潜在威胁
肝豆状核变性(Hepatolenticulardegeneration，HLD)，又名威尔逊病、Wilson病（Wilson disease，WD），是一种遗传性铜代谢异常的肝脏疾病，呈常染色体隐性遗传。本病的发病率存在人种和地域的差异，东亚国家明显高于欧美国家。我国安徽省的一项大样本人群WD流行病学调查显示该病发病率约为1.96/10万。本病是完全可以治愈的，治疗开始愈早，预后愈好[1]。
致病机理
铜的稳态
人们每天从饮食中摄入1.5~5mg的铜元素（Cu），其中 50% ~ 60%未吸收的 Cu 随粪便排出；25% ~40% 从十二指肠吸收，由肠细胞储存。Cu是几乎所有生物体的基本元素，Cu是多种关键代谢酶的辅助因子，这些酶可驱动广泛的生理过程。因此，全身铜水平变化必须维持在一个很小的范围内，以确保正常的生化过程。
Cu的分子伴侣将Cu运送到特定的细胞内靶点，例如：SOD的Cu分子伴侣将Cu运送到SOD；线粒体中的一组分子伴侣蛋白( Cos11、Cos17、SCO1 和SCO2)，将Cu传递给细胞色素氧化酶COX；在反式高尔基网络(Trans-Golgi network，TGN)中，Cu转运蛋白(ATOX1)将Cu转运至Cu转运 ATP酶1(ATP7A)和跨膜 Cu 转运 ATP 酶2(ATP7B)。
ATP7B 有助于将 Cu 转运到 TGN 和 Cu 的胆道排泄。在肝细胞内，ATP7B 在 TGN 或细胞质囊泡中发挥两种重要功能。 在 TGN 中，ATP7B 通过将6个Cu分子运输到原血浆CP中，激活功能性 CP。在细胞质中，当细胞内 Cu 离子水平升高时，ATP7B 将多余的 Cu 释放到囊泡中，并通过胞外排出，穿过根尖管膜进入胆汁。在这一过程中，ATP7B 借助 ATP 水解释放的能量磷酸化，随后脱磷酸化释放 Cu 跨膜所需的能量。
因此，ATP7B依赖性胆汁 Cu 排泄是维持 Cu 代谢平衡的主要方式。
WD患者ATP7B基因变异导致 ATP7B 酶活性改变，由此导致致使铜蓝蛋白合成量减少、胆道排铜出现障碍，过量的铜蓄积在肝、脑、肾、角膜等组织，造成肝细胞死亡和铜渗漏入血，进一步引起肝、脑、眼睛、肾脏等组织器官的损伤，引起一系列临床症状[2]。
致病基因
ATP7B 蛋白属P型ATP 酶超家族，由位于第13号染色体长臂(13q14.3 ~q21.1)，全长约 85 b 的 ATP7B 基因编码。
图2 致病基因ATP7B基本信息 来源：RDDC数据库
WD具有复杂的临床表现，目前已发现超过1000种ATP7B突变。其中380个已经证实与疾病发病机制有关。大多数是错义突变，这些突变对 ATP7B 蛋白结构(例如，ATP7B 完整性的丧失、错误折叠、蛋白间相互作用受损)和功能(磷酸化、Cu离子运输异常、ATP 结合亲和力下降和细胞内运输异常)产生了不同程度的影响。
在欧洲和亚洲人群中，最常见的突变分别是p.His1069GIn和 p.Arg778Leu，其中复合杂合子比纯合子更为常见。在Zhang 等[16]发表的一项共纳入1366例中国WD 患者的评估基因型-表型相关性的研究鉴定出了294 例潜在致病性 ATP7B 变异，包括 116 例新变异，其中48 个可归为“致病变异”。变异频率依次为c.2333G >T (p.Arg778Leu)、c.2975C >T (p. Pro992Leu)、c.2621C >T (p.Ala874Val)[15]。
图3：c.2333G >T (p.Arg778Leu)临床突变 来源：RDDC数据库
图4：c.2975C >T (p. Pro992Leu) 临床突变 来源：RDDC数据库
临床症状
WD患者临床表现多样，因受累器官和程度不同而异主要表现为肝受累和神经系统受累。此外，还可出现眼部异常、溶血、肾脏损伤、骨关节异常等多种临床表现。
肝脏表现：肝脏是 WD 最常累及的器官之一，发病相对较早 (>2 岁就可能发病)，肝受累在临床上表现为一系列广泛的症状和体征，包括无症状的肝脏细微形态学改变、急性单纯性自限性肝炎、重型肝炎、复发性黄疸(存在溶血)、肝硬化伴或不伴门脉高压症，甚至急性肝衰竭(ALF)。
神经系统表现：神经系统病变常较肝病晚 10 年出现(通常 > 15 岁) ，WD 神经系统表现多种多样，但大多为锥体外系功能障碍，常见表现有：肌张力障碍、震颤、肢体僵硬和运动迟缓、精神行为异常，少数患者可出现舞蹈样动作、手足徐动、共济失调等其他少见的神经症状。
眼部表现：K-F 环是铜沉着于角膜后弹力层而形成的绿褐色或暗棕色环，是 WD 的典型特征之一。葵花样白内障是 WD 的另一个眼部表现，为铜沉积于晶状体所致，较为少见。
溶血：WD 可因过多的铜离子损伤红细胞膜而发生 Coombs 阴性的溶血性贫血。溶血性贫血可急性发作，也可呈阵发性或慢性病程。小样本研究结果显示，约 1% 的 WD 患者以溶血性贫血为首发表现，有黄疽的 WD 患者中，溶血性贫血占28%。
其他表现：WD 还可以引起肾脏、骨关节等其他器官组织损害。
肾损伤以肾小管损伤为主，可表现为镜下血尿和肾结石，为近曲小管和远曲小管上皮中的铜沉积损伤肾小管上皮细胞所致；肾小球损伤更多见于整合剂治疗的并发症。
骨关节病并不常见，可表现为骨质疏松症、骨软化症、自发性骨折、佝偻病、剥脱性骨软骨炎、骸骨软骨软化症、过早骨质减少以及膝盖和手腕的退行性关节炎等，与其他骨关节病在临床表现上难以区分。
此外，还可以引起心肌炎、心律失常等心脏损伤，女性闭经、流产，男性乳房发育、睾丸萎缩、甲状旁腺功能减退、胰腺炎等内分泌异常，偶见指甲蓝色隆突和黑棘皮病等。
一些学者还探究了突变基因与疾病表型的关系，如图5：
辅助检查
1.实验室检查
(1)常检
若累及血液系统，可出现贫血、白细胞下降、血小板下降；肝功能检查可见肝酶升高、胆红素升高、胆汁酸升高、凝血时间延长和低蛋白血症等，肾脏检查可见血尿、蛋白尿等。
(2)铜代谢相关检查
绝大多数患者血铜蓝蛋白<0.2g/L，如果<0.1g/L强烈提示肝豆状核变性。24小时尿铜在成人患者中>100g为诊断标准之一，在儿童患者中>40g为诊断标准之一。
2.影像学检查
(1)B超
轻者仅表现为密度增强、减低或不均，还可以表现为肝实质光点增粗、肝脏增大，甚至结节状改变、脾大等肝硬化表现。
(2) 头核磁约85%神经型患者头颅核磁显示异常，主要累及基底节，也可出现中脑和脑桥、丘脑、小脑及额叶皮质等部位的异常信号，还可有不同程度的脑沟增宽、脑室扩大等。在神经系统症状出现之前，部分患者也可出现头颅核磁的异常改变。
3.眼科裂隙灯检查
由于铜沉积于角膜后弹力层，在角膜与巩膜的内表面上出现绿色或金褐色的角膜色素环，即K-F环。有研究提示，肝脏型肝豆状核变性患者中K-F环阳性率为55%，在神经型患者中K-F环阳性率高达90%。在儿童症状前患者中，K-F环阳性率较低。
4.病理学检查
肝脏活检：肝脏最早的组织学异常包括轻度脂肪变性、肝细胞内糖原化和局灶性肝细胞坏死。伴随着病程进展，可出现纤维化、肝硬化。肝豆状核变性患者肝铜含量>250ug/g (千重)，但铜在肝脏中分布不均，铜含量测定可能会受所取标本的影响。
诊断鉴别
肝豆状核变性的诊断较为复杂，常常被误诊为其他疾病。
在实际工作中，肝豆状核变性的专家李新华教授就曾接手过一例发病5年、辗转多家医院、做过许多检查仍无法确诊的患者（化名小何）。李教授分析了病人的病例特点，结合外院及急诊科资料，临床诊断小何得的是CTLN2。据此，采取了不一样的治疗：停止含糖补液、补充脂肪乳及蛋白质、精氨酸静滴等治疗。入院当天晚上患者的神志就恢复了正常，可以自主交流。随后小何的血尿质谱与基因检测结果出来，佐证了李教授的诊断。
因此，对于肝豆状核变性的诊断鉴别应多方面综合分析，结合临床表现、辅助检查及基因分析来下论断。肝豆患者铜蓝蛋白降低、24小时尿铜增高和ATP7B 基因检出致病突变有利于和其他疾病鉴别。
对于肝脏受累为主的患者，应与慢性病毒性感染、自身免疫性肝炎、非精性肝硬化、药物性肝损、原发性硬化性胆管炎、HFE相关的原发性血色素沉着症、a1抗胰蛋白缺乏症和酒精性肝病等鉴别。
对于神经系统受累为主的患者，应与帕金森病、Menkes综合征、遗传性铜蓝蛋白缺乏症、MEDNIK综合征、肌张力障碍、亨廷顿病、原发性震颤、神经退行性病变、中枢神经系统肿瘤及其他遗传代谢病鉴别。
图6：WD与其他Cu代谢指标异常遗传性疾病的鉴别 来源：肝豆状核变性发病机制、临床表型－基因型关系及药物治疗研究进展
动物模型
(1) 小鼠
毒乳(Toxic milk，TX)小鼠：TX小鼠是由DL品系小鼠自然突变产生，由Rauch教授[3]于1983年首次提出。其表型特征为： 色素沉着减少、生长发育不良、震颤、行为运动异常。由于母鼠母乳喂养的致命影响，Rauch将这种新的突变品系命名为毒乳小鼠。由于TX小鼠与WD患者突变基因相同且肝损伤表现突出，目前已广泛应用于WD研究。
Jackson毒乳(the Jackson laboratory toxic milk，TX-J)小鼠：TX-J小鼠，又被称为Jackson毒乳小鼠，是在1987年缅因州巴尔港杰克逊实验室的C3H/HeJ动物资源群体中发现的一种新的常染色体隐性突变体，其遗传缺陷源于Atp7B基因外显子8中2135位的一个自发隐性点突变，导致G712D错义，这与TX小鼠稍有差异。相关研究发现TX-J小鼠在3个月大的时候就表现出丘脑和豆状核的铜过载。随着铜的不断沉积，大脑皮层中的铜浓度也有所升高[4]。TX-J小鼠是一种较理想的WD模型，由于铜沉积出现较早，因此较适合进行铜代谢等方面研究。
ATP7B基因敲除(ATP7B-/-)小鼠：利用同源重组技术敲除ATP7B基因第2外显子的转基因小鼠也越来越多的被用于WD研究。ATP7B-/-小鼠主要表现有低铜蓝蛋白血症、尿铜增加及肝脏铜沉积，与其他模型相比发病较早且肝损伤更严重。ATP7B-/-小鼠的肝脏病理损伤程度取决于铜暴露的时间和细胞内铜的分布。肝损伤包括早期超微结构改变、脂肪变性和轻度炎症(1.5月龄时)，随后出现肝炎、发育不良和晚期坏死性炎症(3~5月龄时)。这些变化伴随的是胆管增生、纤维化的发展，甚至是后期(9月龄)的肿瘤增生。然而，大多数小鼠在严重肝炎中存活下来，并在肝脏的大部分区域表现出显著的再生。因此，ATP7B-/-小鼠不仅是研究铜中毒病理的有效模型，而且为研究铜中毒的代偿机制和防御机制提供了途径。
(2) 大鼠
Long-Evans cinnamon(LEC)大鼠：LEC大鼠是从Long-Evans大鼠群体中分离出来的突变大鼠的自交系， 其与人类基因同源性达80%以上。LEC大鼠主要表现出自发性肝铜异常积聚伴随低血清铜和低铜蓝蛋白，由于此与WD的表现类似，因而被应用于WD的研究。LEC大鼠约4月龄时出现暴发性肝炎或暴发性肝衰竭、转氨酶和胆红素升高及部分或大量肝细胞坏死，病死率＞30%~40%，存活下来的大鼠多在12月龄时发生纤维化并伴有肝细胞癌和胆管癌。LEC大鼠是一种铜快速积累模型，在4月龄时由于严重肝炎和之后的肝细胞癌导致病死率很高。由于其肝病进展迅速，因此特别适合用于进行干预研究。
PINA和ATP7B基因有缺陷(LPP)大鼠：为了消除非ATP7B突变对表型的影响，Ahmed等[5]将LEC大鼠与PVG大鼠杂交，后者为野生型，具有NAT(N-乙酰基转移酶)、ATP7B基因和正常毛色，这一过程产生了具有野生型大鼠NAT和毛色但ATP7B发生突变的新鼠种，称为LPP大鼠。LPP大鼠自出生后肝铜逐渐积累，并在90天左右出现肝生化异常，一旦肝疾病迅速进展，未经治疗的LPP大鼠可在30天内死亡[6]。
图7：常见WD动物模型特点 来源：来源于肝豆状核变性发病机制、临床表型－基因型关系及药物治疗研究进展
(3) 大型哺乳动物
Bedlington犬：Bedlington犬最早也曾被当作Wilson病的动物模型。由于肝铜的聚集引起肝损伤和继发性溶血并表现出与Wilson病患者相似的肝纤维化和肝硬化的肝铜中毒迹象而曾被用作Wilson病动物模型进行铜负荷的相关研究[7]。然而，其潜在的遗传缺陷是在COMMD1基因中发现的而非ATP7B基因[8]。虽然其肝脏铜的积聚和肝脏病理与WD相似，但与啮齿动物模型一样，不存在明显的神经系统缺陷且铜蓝蛋白浓度正常，故目前该模型较少被使用。
拉布拉多寻回犬：2016年，一项关于拉布拉多寻回犬铜中毒的全基因组关联(GWAS)研究[9]表明，C端ATP7B的精氨酸至谷氨酰胺突变与肝脏铜含量增加有关联，从而将其确立为进一步的Wilson病动物模型。
北罗纳德赛羊：北罗纳德赛羊是另一个有趣的哺乳动物肝脏和神经系统铜积累模型。然而，与犬类模型一样，其在临床上和遗传学上与WD不同[10]。其潜在的基因缺陷目前仍然未知。然而，该模型对于研究铜在大脑中的积累等方面有一定的重要性[11]。
治疗指南
原则是促进铜的排泄及减少铜的吸收，建立铜代谢的负平衡。治疗方式主要是低铜饮食和药物治疗。对于本病所致的急性肝功能衰竭或失代偿性肝硬化患儿，经上述各种治疗无效时可考虑进行肝移植。治疗越早，损害越轻，预后越好[12]。
低铜饮食
避免进食含铜高的食物，如坚果、豌豆、软体动物、巧克力等。
药物盘点
1. D-青霉胺
D-青霉胺是世界上第一个口服的治疗 WD 药物，从 1956 年开始临床应用，目前仍是治疗本病的一线药，适用于各种临床类型的 WD 患者，在发展中国家则为首选药。
2.二疏磺酸钠(DMPS)
DMPS 是含有 2 个疏基的重金属整合剂，水溶性好可显著促进重金属的排泄。我国首先用于治疗 WD，其驱铜作用是 D-青霉胺的 2.6 倍，治疗后神经症状加重等不良反应少于D-青霉胺。适用于 ALF 等重症 WD 患者、神经精神症状的 WD 患者，以及对 D-青霉胺过敏，或 D-青霉胺疗效欠佳需要快速驱铜的患者。可与锌剂联合使用，也可与 D-青霉胺、锌剂交替使用。
3.二疏丁二酸(DMSA)
DMSA 是中国科学院上海研究所研制的广谱重金属整合剂，DMSA 驱铜作用较 D-青霉胺弱，但具有脂溶性，能进入血脑屏障，有助于改善神经精神症状，不良反应相对较少。可用于有不同程度肝损伤，或神经精神症状的WD 患者，以及对 D-青霉胺过敏或不耐受者。可与锌剂联合使用，或与 D-青霉胺、锌剂交替使用。
4. 曲恩汀四盐酸盐Cuvrior™（trientine tetrahydrochloride）
是一种口服曲恩汀制剂，曲恩汀四盐酸盐在美国已被授予孤儿药资格，用于治疗对青霉胺不耐受的威尔逊病患者。2022年9月21日，中国国家药监局药品审评中心（CDE）发布消息，Orphalan公司研发的新型药物四盐酸曲恩汀薄膜衣片在中国获得了优先审批，2023有望获批在中国上市。
5. 四硫钼酸盐（Tetl．athiomolybdate，TM）
双胆碱四硫代钼酸盐（Tiomolibdate，商品名Decuprate），是目前正在研究的四硫钼酸盐和胆碱合成的一种盐，是针对Wilson病的临床开发中的去铜疗法，其代号为WTX101，由Wilson Therapeutics AB提供。Wilson Therapeutics由HealthCap于2012 年创立。Decuprate在美国和欧盟已获得孤儿药地位，作为Wilson病潜在治疗方案。
6. 锌制剂：
硫酸锌、葡萄糖酸锌、醋酸锌等锌盐类药物可降低血液循环中游离铜的水平，促进脑部受累的改善，作为治疗Wilson病方案的一部分[13]。
7. 二巯基丙醇（Dimercaprol）
二巯基丙醇也被称为路易氏剂（BAL），是一种铜螯合剂，已被FDA批准用于治疗Wilson病。少部分患者偶尔需要注射二巯基丙醇解毒[14]。
此外，根据神经精神方面的不同症状可选用苯海索、左旋多巴、安定类或抗精神病药物等。
参考资料：
[1]https：//lczl.med.wanfangdata.com.cn/Home/DiseaseDetail?Id=JB23049
[2]黄稚真，胡敏，梁惠卿，艾兆秀 & 孙雨洁.(2023).化痰祛瘀法治疗肝豆状核变性研究进展. 陕西中医(06)，815-817.
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[4]PRZYBYŁKOWSKI A， GROMADZKA G， WAWER A， et al. Neurochemical and behavioral characteristics of toxic milk mice： an animal model of Wilson's disease[J]. Neurochem Res， 2013， 38(10)： 2037-2045. DOI： 10.1007/s11064-013-1111-3.
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[12]肝豆状核变性诊疗指南（2022版）
[13]https：//mp.weixin.qq.com/s/Osr1e_I5W10WrUp1swHX1A
[14]http：//www.100pei.com/5029.html
[15]玛力帕提·艾尔肯江，凯迪日亚·库尔班，徐玲，孙晓风.肝豆状核变性发病机制、临床表型-基因型关系及药物治疗研究进展[J].临床肝胆病杂志，2023，39(6)：1497-1504.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.06.037.
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