NEJM | AAV基因治疗严重血友病B，10名患者长达13年的安全性及疗效评估数据
一、研究概述
2025年6月12日，伦敦大学学院（University College London）Amit C. Nathwani教授团队在The New England Journal of Medicine发表标题为“Sustained Clinical Benefit of AAV Gene Therapy in Severe Hemophilia B”的研究论文，该研究主要对10名接受scAAV2/8-LP1-hFIXco基因治疗的严重血友病B患者进行了长达13年的随访，评估了治疗的安全性和疗效，结果显示单次给药后因子IX表达持久稳定，临床出血率和因子IX浓缩物使用显著降低，且未出现迟发性安全问题，证实了AAV基因治疗的长期有效性和安全性。
背景：腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗已成为治疗血友病B的一种有前景的方法。目前已有13年的随访数据，评估了接受scAAV2/8-LP1-hFIXco基因治疗的患者队列的安全性和疗效持久性。
方法：10名患有严重血友病B的男性患者接受了scAAV2/8-LP1-hFIXco载体的单次静脉输注，分为三个剂量组（低剂量组：2×10¹¹载体基因组[vg]每千克体重[2名患者]；中剂量组：6×10¹¹ vg每千克体重[2名患者]；高剂量组：2×10¹² vg每千克体重[6名患者]）。疗效评估指标包括因子IX活性、年化出血率和因子IX浓缩物的使用情况。安全性评估包括临床事件、肝功能和影像学检查。
结果：患者的中位随访时间为13.0年（范围为11.1至13.8年）。在不同剂量组中，因子IX活性保持稳定，低剂量组的平均因子IX水平为1.7 IU/分升，中剂量组为2.3 IU/分升，高剂量组为4.8 IU/分升。10名患者中有7名未接受预防性治疗。患者的中位年化出血率从14.0次（四分位距为12.0至21.5）降至1.5次（四分位距为0.7至2.2），降低了9.7倍。因子IX浓缩物的使用量降低了12.4倍（四分位距为2.2至27.1）。
共发生15例与载体相关的不良事件，主要为短暂性转氨酶水平升高。没有患者出现因子IX抑制剂、血栓形成或慢性肝损伤。虽然发现了2例癌症，但经过研究者和多学科专家团队的评估，认为这些癌症与载体无关。在1名患者接受输注10年后进行的肝活检显示，肝细胞中存在转录活性的转基因表达，且未出现纤维化或异型增生。在整个随访期间，AAV8的中和抗体水平一直较高，这表明再次使用该载体可能存在潜在障碍。
结论：单次使用scAAV2/8-LP1-hFIXco基因治疗可实现持久的因子IX表达，持续的临床益处，并在13年内未出现迟发性安全性问题。这些数据支持AAV基因治疗对严重血友病B的长期有效性和安全性。
二、导读
血友病B是一种X染色体隐性出血性疾病，由F9基因突变引起，导致功能性凝血因子IX蛋白生成减少。重度血友病B患者（因子IX活性<1%或<1 IU/分升）常发生自发性出血事件，导致慢性关节病变和潜在的危及生命的出血。尽管目前的标准治疗——终生使用因子IX浓缩物进行预防——能够改善预后，但这种治疗仍然具有侵入性、成本高昂且负担沉重。
2014年，作者报告了对重度血友病B患者进行的成功基因治疗，这些患者接受了一次性静脉输注自互补、8型血清腺相关病毒（AAV）载体（scAAV2/8-LP1-hFIXco），该载体编码优化密码子的因子IX转基因。作者发现，糖皮质激素能够有效抑制针对AAV转导肝细胞的免疫反应，从而维持转基因因子IX的水平。随后，其他研究者（包括使用帕多瓦功能增强型因子IX变体的研究）验证了这些发现，为重度血友病患者的基因治疗药物etranacogene dezaparvovec（Hemgenix）和fidanacogene elaparvovec（Beqvez）的有条件市场授权铺平了道路。这些获准上市的疗法产生的因子IX活性水平高于野生型因子IX变体的载体，但因子IX蛋白水平相似。
然而，关于转基因表达的持久性仍存在不确定性，因为转移的AAV载体表达盒主要以游离体形式存在，并且随着转导肝细胞的分裂，可能会随着时间的推移而丢失。此外，AAV介导的基因转移的长期安全性仍不清楚，且对AAV的体液免疫反应的影响需要持续评估。
在此，本研究提供了10名接受scAAV2/8-LP1-hFIXco单次冲击输注治疗的重度血友病B患者的长达13年的随访数据，以评估长期安全性和转基因表达的持久性，进而判断其是否能够持续预防自发性出血。
三、正文
1. 参与者和随访截至2023年12月31日，研究参与者的中位随访时间为13.0年（范围为11.1至13.8年）。研究参与者的基因转移前后特征见表1。在一名参与者接受基因治疗后10年进行了一次肝活检，以在单独方案下进行分子分析。
2. scAAV2/8-LP1-hFIXco的长期安全性自2010年以来，共报告了354例不良事件（表S2，见原文）。未观察到因子IX抑制剂、血栓形成、复发性转氨酶升高或死亡病例。共有15例不良事件被研究者认为与AAV基因治疗相关，包括在接受高剂量载体治疗的6名参与者中的4名出现短暂性肝转氨酶水平升高（1级或2级），这导致其中2名参与者因糖皮质激素治疗延迟而出现转基因表达显著降低。到第5个月时，丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平恢复正常。对遵循评估时间表的参与者进行的肝脏超声检查和胸部计算机断层扫描显示，未发现持续的肝损伤、纤维化、癌症或肺部病理改变。
根据方案要求，报告了两例癌症作为严重不良事件。在接受基因治疗后7.0年，一名44岁、吸烟史约10包年（27年间）的参与者在因复发性气胸接受肺大疱切除术后，偶然发现肺原位腺癌。另一名74岁的参与者在接受基因治疗后11.6年被检测出前列腺腺癌。分子分析和多学科专家团队的评估表明，这两种癌症很可能与基因治疗无关。更多详细信息见补充附录。
3. scAAV2/8-LP1-hFIXco的持续临床益处在接受scAAV2/8-LP1-hFIXco输注后3.2年的中位时间点，所有参与者的因子IX凝血活性均呈剂量依赖性增加，低剂量组的平均（±标准差）水平为1.8±0.7 IU/分升，中剂量组为2.5±0.9 IU/分升，高剂量组为5.1±1.7 IU/分升（所有水平均在第4个月后评估）。
在长达13年的中位研究期间，因子IX活性保持稳定，低剂量组的平均水平为1.7±0.3 IU/分升，中剂量组为2.3±0.5 IU/分升，高剂量组为4.8±1.7 IU/分升。截至2023年12月31日，高剂量组（中位值，5.2 IU/分升；四分位距[IQR]，3.5至5.7）与低剂量和中剂量组联合（中位值，1.9 IU/分升；IQR，1.8至2.1）之间的稳态因子IX活性水平差异为3.3 IU/分升（图1）。
3名患有重度血友病性关节病变的参与者（参与者2、3和5；中位目标关节数为10）在接受基因治疗后4年内因复发性自发性关节出血事件而恢复因子IX预防治疗。这些参与者在接受输注后至少3天测量的因子IX水平为1至3 IU/分升，结果表明该水平不足以防止此类出血，这一发现突显了关节健康和其他生物因素在接受基因治疗后对结果的影响。相比之下，7名参与者（参与者1、4、6、7、8、9和10）的因子IX水平维持在2至7 IU/分升，这些参与者在长期随访期间未接受预防治疗。
在接受基因治疗前，所有10名参与者（包括3名接受按需治疗的参与者）的中位年化出血率为14.0次（IQR，12.0至21.5）。在接近13年的随访后，所有10名参与者的中位年化出血率为1.5次（IQR，0.7至2.2）（图S1，见原文），与治疗前相比，中位出血率降低了9.7倍（IQR，3.7至21.8）。在高剂量组的6名参与者中，年化出血率降低了16.4倍（IQR，9.7至31.3），中位值为每年1.0次出血事件（IQR，0.4至2.0），而治疗前的中位值为每年21.0次（IQR，16.2至27.2）。
事后评估显示，在接受基因治疗后1年，中位年化出血率为5.3次（IQR，3.3至9.0），而在接受基因治疗后11年，中位值降至1.5次（IQR，0.6至2.3），在基因治疗后6个月因子IX水平高于3 IU/分升的患者中，这种降低在10年期间的中位降低倍数为3.9（IQR，2.1至8.2）。这些降低表明，持续的因子IX表达，尽管水平较低，可能减轻了既往存在的滑膜炎和炎症，可能为防止出血提供了长期保护，并减轻了进一步的关节损伤。
在接受基因治疗前，因子IX浓缩物的中位年使用量为2613 IU/千克（IQR，1671至4513）。在接受基因治疗后的13年期间，因子IX浓缩物的使用量降低了12.4倍（IQR，2.21至27.1），在13年时降至367 IU/千克（IQR，60至1597）（图S2，见原文）。在高剂量组中，因子IX浓缩物的使用量从2613 IU/千克（IQR，1627至3487）降至171 IU/千克（IQR，60至432），降低了14.7倍（IQR，11.9至27.1）。
在接受基因治疗后10年，对高剂量组的参与者8进行的经颈静脉肝活检显示，肝小叶结构保持完整，未见坏死、纤维化或异型增生。原位杂交检测到hFIXco DNA存在于平均10.3±3.4%的肝细胞中，RNA原位杂交显示平均5.5±2.3%的肝细胞中有活跃的转录，表明超过一半的转基因阳性肝细胞处于转录活性状态。未观察到活跃和非活跃肝细胞之间的分离（图S3，见原文）。这一单一肝活检样本提供的数据仅限于采样区域，可能无法完全反映整个肝脏的转基因表达情况。然而，它显示了在一部分转导的肝细胞中持续的转基因转录。
4. 高滴度中和AAV抗体的持续存在对8名数据充分的参与者（参与者1、2、3和5至9）的分析显示，针对AAV8衣壳的总IgG抗体和中和抗体水平呈剂量依赖性增加，这两项指标显示出相似的动力学特征（图2）。
在1年时，中和抗体水平中位增加了3721.3倍（IQR，1374.7至6640.0），并且比对照组的值高出300倍以上（高出392.5倍；对照组中位值为43.6 [IQR，5.0至96.5]；参与者中位值为17,100.0 [IQR，13,530.2至27,125.0]）（图S4，见原文）。
到5年时，高剂量组的中和抗体水平虽然有所下降，但仍比基线值高出2400倍以上（中位值为2427.8倍 [IQR，459.1至3340.0]），这超过了基于体外实验经验设定的成功基因转移的预设阈值。
与AAV5和AAV3b的交叉反应呈剂量依赖性。在小鼠实验中，从参与者接受治疗后5年以上获得的血清样本抑制了AAV8的转导，但允许有限的AAV5转移（图S5，见原文）。
四、结论
本研究的13年纵向研究为10名接受AAV基因治疗且成功治愈的重度血友病B患者提供了长期观察数据。除短暂性肝转氨酶水平升高外，未观察到与AAV相关的长期或新的不良事件。因子IX表达保持稳定，其中7名参与者未接受因子IX预防治疗。从临床角度看，AAV基因转移使得年化出血率和因子IX浓缩物使用量降低了9倍以上，显著减轻了疾病负担。这些发现支持了AAV基因治疗对血友病B的长期安全性和有效性，为这一患者群体提供了一种有前景且持久的治疗选择，尤其是随着近期获批的基因治疗产品的出现。
两名参与者出现了肿瘤病变。根据方案要求，这些病变被报告为可能与AAV相关的严重不良事件。然而，随后的分子调查和多学科专家团队的评估表明，这些事件很可能与AAV基因治疗无关，而是归因于在普通人群中常见的年龄相关或环境风险因素。然而，对血友病A犬的长期研究表明，AAV载体插入在与人类癌症相关的基因附近的肝细胞中出现了克隆扩增。尽管在这些犬中未观察到明显的结节形成或转化，但这一发现突显了对AAV介导基因治疗潜在长期效应进行长期监测和进一步研究的重要性。
如其他研究中所报告的那样，部分参与者出现了无症状的、与载体相关的肝转氨酶水平升高（1级或2级），但并未导致肝功能的持续损害。糖皮质激素似乎能有效控制肝转氨酶水平。尽管肝细胞损伤的确切机制尚不清楚，但由于存在肝酶水平迟发性升高和暴发性肝衰竭的潜在风险，因此密切监测至关重要。对一名参与者在基因转移后10年进行的肝活检样本显示，该患者的持续转基因因子IX表达和止血保护是由一小部分具有转录活性的肝细胞所驱动的，且未发现活动性炎症或组织学异常。然而，这些数据仅来源于有限的采样区域，可能无法完全反映整个肝脏的转基因表达情况。尽管由于缺乏足够的DNA而无法进行整合分析，但基于对人类和动物模型中AAV生命周期的当前理解，作者推测在基因治疗后早期，整合型和游离型转基因均对表达有所贡献。然而，鉴于游离型基因组在肝细胞更新的背景下（成人中约为12个月）会逐渐丢失，因此随着时间的推移，转基因表达主要可能由整合型基因组所维持。
在其他疾病（如脊髓性肌肉萎缩症和遗传性视网膜营养不良）中也观察到了具有临床益处的持久AAV介导的转基因表达。然而，在血友病A和B的动物模型以及人类中也有报道转基因表达丢失的情况。在这些患者中，低水平的转基因因子VIII提供了对自发性出血的保护——这一发现与本研究的结果一致。总体而言，这些观察结果突显了转基因表达持久性的复杂性和多因素性质，因为这涉及到AAV基因组、靶向疾病、免疫和非免疫因素（包括载体设计和表观遗传学）以及患者特征之间的相互作用。
对AAV的体液免疫反应在各种疾病、给药途径和血清型中均有观察到，但这些反应在人类中的长期持续性仍有待深入研究。在本研究中，基因治疗后至少10年，针对AAV8的高滴度中和抗体持续存在，并具有广泛的交叉反应性——这一发现与另一份报告一致。尽管在人类和非人灵长类动物中，环境暴露后的中和抗体水平相似，但对静脉注射重组AAV的反应在人类中却高出几个数量级。这一发现表明了物种特异性的免疫反应差异。尽管替代血清型可能为载体再给药提供了潜在机会，但它们在完全克服人类中持续高水平的交叉反应性中和抗体方面的有效性仍不确定，这表明对于大多数患者而言，AAV介导的基因治疗可能是一次性的机会。
在本项研究中，对重度血友病B男性患者的13年纵向随访证实了AAV基因治疗的长期安全性以及因子IX表达的持久性，这些成果伴随着止血功能的持续改善以及因子IX预防治疗使用量的减少。