Igs7^{tm195(tetO-GCaMP7s,CAG-tTA2)Tasic}

这个靶向载体包含了从5'到3'的方向：Bxb1 attB位点、一段非功能的500bp绿色荧光蛋白序列（用于增加Bxb1 attB和绝缘序列之间的空间以提高载体稳定性），两个鸡β-珠蛋白HS4绝缘元件的拷贝（减少在无转录激活剂时报告基因的表达），一个Tet响应元件/启动子（TRE2，详情如下）、一段由loxP标记的终止子（包含所有三个读框的终止密码子，连接到pA-hGHpA-PGKpA合成序列），一个GCaMP7敏感且反应较慢的钙指示器序列（jGCaMP7s，详情后述）、一个6xHis标签、T7标签和XPress标签序列，一个木鼠肝病毒的后转录调节元件，一段BGHpolyA，两个鸡β-珠蛋白HS4绝缘元件，一个CMV-IE增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白的混合启动子，一个FRT标记的终止子（所有三个读框的终止密码子连接到pA-hGHpA-TKpA合成序列），一个内质网进入信号序列（IRES），一个合成的修改型四环素响应转录激活器基因（tTA2(S)），一个WPRE，一段BGHpolyA，一个ΦC31 attB位点，一段5'的PGK-5'hygro插入片段，一个RNA剪接供体，以及一段Bxb1 attR-SA-3'hygro-SV40pA-ΦC31 attP。使用的TRE2启动子是Tet响应的P)hCMV*-1，它包含7个tetO序列的19bp响应元件上游的最小CMV启动子（P)min CMV，后者不包含完整的CMV启动子中的增强子。因此，没有tTA或rtTA与tetO结合时，P)hCMV*-1是沉默的。jGCaMP7s是一个对神经活动极为敏感的超灵敏钙指示器，具有较慢的衰减和响应速度。它是一个改良的GCaMP6s融合基因，包含鸡肌动蛋白轻链激酶的M13片段（也称为钙结合肽(CBP)），一个环转的EGFP（cpEGFP，149-238序列后是1-144序列的变异以增加动态范围和基线荧光，以及提高敏感性和减缓反应速度），以及一段鼠钙调素DNA片段（CaM，2-148序列的变异以增加小钙信号的荧光变化）。cpEGFP到CaM链接处的氨基酸替换优化了传感器功能。此外，jGCaMP7s还带有CBP的A52V突变和CaM的A317L突变。（来源：J:101977）