Igs7^{tm148.1(tetO-GCaMP6f,CAG-tTA2)Hze}

替换载体设计如下：从5'至3'，包含FRT3位点、两个鸡β-珠蛋白HS4绝缘子元件、tet响应元件/启动子(TRE2)、一段loxP引导的终止子、GCaMP6快速变体钙指示器序列(GCaMP6f，详细信息随后给出)、WPRE、BGHpolyA、两个鸡β-珠蛋白HS4绝缘子元件、CMV-IE增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白融合启动子(CAG，来自pCAGGS)、lox2272引导的终止子、合成的四环素调控转录激活因子基因(tTA2S)、WPRE、BGHpolyA、AttB位点、PGK-5'hygro cassette、RNA剪接供体以及FRT5位点。先前在TIGRE中通过FRT3::AttB::PGK-neoR-polyA::FRT5::splice acceptor::3'hygro cassette::SV40 polyA:AttP对胚胎干细胞进行靶向，现在通过重组酶介导的 cassette exchange (RCME)技术，用替换载体和Flp重组酶进行转染。通过Phic31介导的重组，移除了AttB/AttP-介导的序列(PGK-Neo-polyA::frt5::RNA splice acceptor::3'hygro-polyA)，并替换为重组的AttB/AttP位点(AttL)。GCaMP6f融合基因包含鸡肌动蛋白轻链激酶的M13片段、环化反式绿色荧光蛋白(Circ-EGFP)和大鼠钙调素DNA片段。GCaMP6f是一种快速响应、对单个神经动作电位敏感的钙指示器，是GCaMP5G的改进版。相比GCaMP6s，它具有更快的响应速度但敏感度较低且衰减更快。在无钙结合时，会观察到环状EGFP的暗淡荧光，因为其筒仓外部有一个通孔通向色素分子。钙结合时，该孔被占据，荧光强度增加。(来源：J:101977, J:260362)