长读长测序揭示结节性硬化症的隐藏遗传变异

一、研究背景与目的

结节性硬化症（TSC）是由TSC1或TSC2基因突变引起的多系统疾病，约85%-90%患者携带杂合变异，5%为镶嵌变异，但部分患者常规技术检测不到突变（NMI）。研究团队假设NMI患者的致病变异可能为结构变异（SV）或深层内含子变异，因此采用靶向长读长测序技术对26例NMI患者进行基因分析，以识别被遗漏的致病变异。

二、研究方法

研究纳入2022-2023年26例符合2021年国际TSC诊断标准的NMI患者，排除特殊病史者。采用PacBio SMRT平台进行靶向长读长测序，覆盖TSC1、TSC2及26个相关基因的外显子、内含子、非翻译区，平均读长3598 bp。结合ONT-WGS、OGM、ddPCR、MLPA及Sanger测序等技术验证变异，并通过Sniffles和DeepVariant软件分析结构变异（SV）和单核苷酸变异（SNV）。

三、研究结果

长读长测序在14例（53.8%）患者中检出疑似致病变异，包括8个结构变异、4个插入缺失（InDels）和2个剪接变异，其中8例为镶嵌变异，6例为种系变异。

关键发现如下：

大片段缺失：6例患者存在TSC1或TSC2的大片段缺失，镶嵌缺失大小3.5-38.6kb，变异等位基因频率（VAF）2.1%-15.2%，如TSC-T7的TSC1外显子9-12缺失（VAF2.06%）。

复杂结构变异：TSC-T5中发现44kb的镶嵌插入，通过长读长测序、ONT-WGS和OGM联合分析，确定为包含片段重复和反向连接的复杂重排。

反转录转座子插入：首次在TSC患者中发现2例新生转座子插入，TSC-T20的TSC2内含子插入Alu元件，TSC-T27的TSC2外显子插入SVA元件，后者导致移码突变。

剪接变异：2例患者携带c.848+281C>T剪接变异，因常规检测未覆盖该区域而被遗漏，该变异激活隐蔽剪接位点，导致假外显子插入和提前终止密码子。

RNA Splicer应用：预测TSC-T20的Alu插入可导致RNA中82bp假外显子插入，干扰正常剪接，为变异致病性提供理论支持（因缺乏患者RNA样本未实验验证）。

四、研究结论与意义

长读长测序在NMI患者中检出率达53.8%，能有效检测镶嵌结构变异、转座子插入等传统技术难以识别的变异，尤其适用于低频率镶嵌变异（如VAF<5%）的检测。首次在TSC中报道镶嵌复杂结构变异和反转录转座子插入，扩展了TSC的致病变异谱，证实TSC患者中镶嵌变异比例（57.1%）高于既往认知。建议对NMI的TSC患者采用长读长测序补充检测，尤其适用于有生殖规划需求者；RNA Splicer等工具可辅助预测内含子变异对剪接的影响，为功能研究提供方向。

RDDC网站上的AI工具在每次预测时均会进行全新计算，因此不同次的预测结果并非固定不变。