ABCA4基因深度内含子变异导致近半数未解决的Stargardt病例具有较轻表型

一、研究背景与目的

Stargardt病（STGD）是常见遗传性视网膜疾病，由ABCA4双等位基因变异引起，但常规外显子测序（ES）仅能解释60%-70%病例。深度内含子变异（DIVs）可能是未解决病例的重要原因。本研究探究ABCA4基因DIVs在中国STGD队列中的贡献及临床特征。

二、研究方法

（一）研究对象

• 本研究纳入了40个通过常规ES未明确病因的STGD家系，同时选取了212个已通过常规ES明确病因的STGD家系作为非DIV组对照。

（二）基因检测与变异分析

• 深度内含子变异检测：对40个未解决的STGD家系进行基因组测序（GS）或增强ES。
• 生物信息学预测：利用SpliceAI和RDDC的RNA Splicer工具对ABCA4基因DIVs的剪接效应进行预测。
• 功能验证：通过minigene实验对新发现的DIVs进行剪接异常验证。将野生型和突变型迷你基因构建体转染到HEK293细胞中，提取RNA进行RT-PCR和Sanger测序分析，半定量评估正确和错误剪接的mRNA比例。
• 临床评估：全面眼科检查，优化分级标准评估黄斑病变。

三、研究结果

（一）ABCA4基因DIVs的贡献

• 在40个未解决的STGD家系中，通过GS或增强ES在18个家系（45.0%）中检测到ABCA4基因DIVs，包括2个新变异和5个已知变异。其中，c.161-395G>A是最常见的DIV等位基因，频率为30.6%（11/36）。DIVs在所有STGD家系中的总体贡献率为7.8%（18/230）。

（二）RDDC工具在变异分析中的作用

• RDDC的RNA Splicer工具对7个ABCA4基因DIVs的剪接效应进行了预测，结果显示所有DIVs均导致假外显子插入或内含子保留。例如，对于c.161-395G>A变异，RDDC预测其可能导致多种异常剪接模式，包括不同大小的假外显子插入（PE1b、PE1c、PE1d），这为后续的实验提供了重要的理论依据。

（三）迷你基因实验验证结果

• 对4个DIVs（2个新变异和2个已知变异）进行的迷你基因实验证实，这些变异均会导致异常剪接，与RDDC预测结果一致。半定量分析显示，这些DIVs的错误剪接mRNA比例均超过50%。

（四）临床表型特征

• 与非DIV组相比，DIV组患者表现出更轻的临床表型。DIV组发病年龄更晚（11.0岁vs9.0岁），眼底病变更局限、进展慢，OCTA显示毛细血管灌注减少但范围小。

四、研究结论

ABCA4基因DIVs导致近半数未解决STGD病例，占所有家系7.8%。RDDC工具助力变异功能预测，DIVs相关表型轻与部分正常mRNA保留有关。研究为STGD遗传诊断提供新方向，提示重视DIVs检测，为剪接调控治疗提供潜在靶点。此外，DIVs患者保留的部分正常mRNA转录本为未来基于剪接调控的治疗策略（如反义寡核苷酸治疗）提供了潜在靶点。

RDDC网站上的AI工具在每次预测时均会进行全新计算，因此不同次的预测结果并非固定不变。