ANK1基因新生变异通过影响前体mRNA剪接导致两名中国儿童遗传性球形红细胞增多症

一、研究背景与目的

遗传性球形红细胞增多症（HS）是一种常见的遗传性溶血性疾病，主要因红细胞膜蛋白异常所致，临床表现为贫血、黄疸和脾肿大等。本研究纳入两个具有典型HS表现的中国儿童家庭，旨在探究ANK1基因新型变异对基因剪接的影响，以减少HS误诊率，增进临床对该疾病的认识。

二、研究方法

研究对象为两个无血缘关系的家庭，其先证者均在出生时或出生后不久出现进行性加重的黄疸。通过收集家族史并构建基因型家系谱，采集家庭成员外周血样本进行基因组DNA提取，采用靶向新一代测序技术对约700个血液/免疫系统遗传病相关基因进行外显子捕获测序，经生物信息学分析和Sanger测序验证候选变异。利用RNA Splicer和SpliceAI预测ANK1基因变异对剪接的影响，并通过minigene实验（构建野生/突变型质粒转染HEK293T细胞，RT-PCR结合测序）验证变异对mRNA剪接的影响。

三、研究结果

（一）病例介绍

患者1（8岁男童）出生即表现虚弱、易疲劳和肤色异常，4年前出现脾肿大，实验室检查提示严重贫血伴球形红细胞增多和渗透脆性增加；

患者2（1月女婴）表现为出生后黄疸加重伴肝脾肿大，实验室检查符合溶血性贫血特征，外周血见球形红细胞，骨髓红系增生活跃。

（二）分子遗传学分析

在两名先证者的ANK1基因中发现新型变异：c.1305+2T>A（家族1）和c.1305+2del（家族2），经Sanger测序验证为新生变异，未在1000数据库、dbsNP数据库和ESPexon数据库中检测到，根据ACMG指南分类为致病性变异。

（三）RDDC RNA Splicer预测结果

c.1305+2del变异：可产生三种剪接形式，包括11bp插入（提供选择性剪接供体）、99bp缺失（导致外显子跳跃）和551bp插入（导致提前终止密码子）。

c.1305+2T>A变异：可产生三种剪接形式，包括12bp插入（提供选择性剪接供体）、99bp缺失（导致外显子跳跃）和552bp插入（导致提前终止密码子）。

（四）Minigene剪接实验验证

实验结果与RDDC预测部分一致：

• 转染c.1305+2T>A突变质粒的细胞中，检测到两种异常转录本：r.1305_1306ins1305+1_1305+229和r.1305_1306ins1305+1_1305+552。
• 转染c.1305+2del突变质粒的细胞中，检测到两种异常转录本：r.1305_1306ins1305+1_1305+228和r.1305_1306ins1305+1_1305+551。

四、研究结论

本研究发现的ANK1 基因 c.1305+2 T>A 和 c.1305+2del 新生变异通过导致前体 mRNA 异常剪接，成为两例中国儿童 HS 的致病原因。RDDC 工具为剪接机制研究提供关键预测，实验结果与之吻合，丰富了 HS 分子发病机制认知，为临床基因诊断和遗传咨询奠定基础。

RDDC网站上的AI工具在每次预测时均会进行全新计算，因此不同次的预测结果并非固定不变。