微光基因松阳洲组成功开发高效的基于相分离蛋白辅助的CRISPR转录激活工具

Release Time: 2023-05-15

  CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统已被广泛用于许多不同生物体的基因组工程和转录调控,一系列报道证明基于转录激活因子与CRISPR-Cas系统的效应蛋白融合,可以实现对內源基因的转录激活,并开发出了多种类型的转录激活工具CRISPRa(CRISPR activation)[1-4]。CRISPR特异的转录调控工具可以通过调节基因的表达而不会造成永久性的DNA损伤,不会产生有害突变和脱靶效应。在临床上,其可以通过同时调节多个基因活性来提供更好的治疗效果,弥补基因治疗存在的不足。但以CRISPRa为代表的基因调控平台因为转录激活效率低下,通常需要融合多种蛋白组件,进而导致其大小超过AAV递送系统的包装极限,极大地限制了其在体内基因治疗中的应用。因此,亟待开发作用效果更强、作用元件更简洁的基因转录调控工具。

  近年来,相分离对转录的调控研究已经越来越被大家所关注,如转录因子及RNA聚合酶Ⅱ可通过多价互作介导的相分离机制在启动子位点聚集,促进高效的基因转录起始和延伸[5-9]。那么利用CRISPRa系统与相分离蛋白融合,相分离蛋白是否可以通过介导多价互作使CRISPRa在靶位点浓缩聚集,从而实现基因转录的高效激活呢?这是一个值得探讨的科学问题。

  近日,联盟单位——微光基因(苏州)有限公司团队中山大学生命科学学院的松阳洲教授团队Protein & Cell杂志发表题为CRISPR-assisted transcription activation by phase-separation proteins的文章,首次将dCas9-VPR(VP64-P65-RTA)转录激活系统与相分离蛋白的IDR(intrinsically disordered region)融合, 证明相分离蛋白辅助的CRISPRa系统可以显著提高哺乳动物细胞中內源基因的表达激活效率,并且该系统具有更宽的gRNA设计窗口(转录起始上游>200 bp)及更低的DNA链靶向偏好性,同时也具有较高的靶向特异性。该研究为精准靶向的转录调控工具的开发与优化提供了新思路;开发的高效转录激活工具在大部分靶位点优于现有激活工具,且作用元件更为简洁;在遗传疾病的治疗应用方向有很大潜力。

 

图1.Protein & Cell杂志官网截图

 

  dCas9-VPR系统单独起作用时, DNA结合位点只能结合有限拷贝数的VPR,但当dCas9-VPR与相分离蛋白融合后,可以通过相分离蛋白介导的弱多价相互作用募集同类蛋白,使靶位点结合的VPR拷贝数极大提高,从而更高效的激活基因表达(图1 A)。因此,研究人员把dCas9-VPR与不同的相分离蛋白融合表达,发现不同的相分离蛋白都能使dCas9-VPR的转录激活效率得到提高(图1 B-C)。其中dCas9-VPR-FUS IDR融合蛋白在不同靶基因中都能有显著转录激活效果,且融合蛋白更小,因此研究人员后续研究集中在dCas9-VPR-FUS IDR融合蛋白,并简称为dCas9-VPRF系统。

  随后,研究人员进一步研究了dCas9-VPRF系统的转录激活特性,在不同靶基因的上游设计了多对gRNA并分别检测靶向链和互补链的激活转录水平。与dCas9-VPR进行对比,发现在多个位点中dCas9-VPRF系统的转录激活效率都更高,并且dCas9-VPRF系统具有更宽的gRNA设计窗口(转录起始上游>200 bp)及更低的DNA链靶向偏好性。

  为了测试dCas9-VPRF系统与其他高效CRISPRa(SAM, SUN, SPH)系统的差异,研究人员对比了在同一基因位点上各个系统的转录激活效率,发现在大部分检测的位点中dCas9-VPRF系统也具有更高的转录激活效率。

  最后,研究人员进一步探究了dCas9-VPRF系统的靶向特异性, 通过表达谱数据分析发现:dCas9-VPRF系统与dCas9-VPR的特异性相当,在高效激活目的基因的同时具有较好的靶向性。

  综上所述,该项工作证明了相分离蛋白融合CRISPRa系统可以使转录激活效率进一步提高,为CRISPRa工具的开发提供了新思路。该项研究开发了新型相分离蛋白辅助的转录激活工具dCas9-VPRF,相比现有的CRISPRa系统具有更高的转录激活效率和gRNA设计窗口,且具有较高的特异性。该研究拓展了CRISPRa工具开发与优化的设计思路,开发的高效转录激活工具dCas9-VPRF有望进一步应用在遗传疾病治疗产品中。

  松阳洲教授课题组2018级博士生刘嘉琪和副研究员陈昱僖为该论文的共同第一作者,松阳洲教授和梁普平副教授为共同通讯作者,微光基因(苏州)有限公司为合作单位。

关于微光基因

  微光基因于2021年在苏州成立,以新型基因编辑工具和细胞基因治疗方法开发为支点,致力于新型基因编辑技术的研发与产业化。公司团队在基因编辑、蛋白质科学及衰老、罕见病等研究领域有深厚积累,是全球最早在遗传疾病治疗中探索应用CRISPR基因编辑技术的团队之一,并曾发现多个衰老领域的重要蛋白与信号通路。微光基因于2021年在苏州成立,以新型基因编辑工具和细胞基因治疗方法开发为支点,致力于新型基因编辑技术的研发与产业化。公司团队在基因编辑、蛋白质科学及衰老、罕见病等研究领域有深厚积累,是全球最早在遗传疾病治疗中探索应用CRISPR基因编辑技术的团队之一,并曾发现多个衰老领域的重要蛋白与信号通路。

 

参考文献

[1]Chavez, A., et al., Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature methods, 2015. 12(4): p. 326-328.

[2]Tanenbaum, M.E., et al., A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell, 2014. 159(3): p. 635-46.

[3]Konermann, S., et al., Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015. 517(7536): p. 583-8.

[4]Zhou, H., et al., In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci, 2018. 21(3): p. 440-446.

[5]Lu, H., et al., Phase-separation mechanism for C-terminal hyperphosphorylation of RNA polymerase II. Nature, 2018. 558(7709): p. 318-323.

[6]Chong, S., et al., Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. 2018. 361(6400): p. eaar2555.

[7]Boija, A., et al., Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains. Cell, 2018. 175(7): p. 1842-1855.e16.

[8]Cho, W.K., et al., Mediator and RNA polymerase II clusters associate in transcription-dependent condensates. Science, 2018. 361(6400): p. 412-415.

[9]Sabari, B.R., et al., Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science, 2018. 361(6400).

 

原文链接:https://doi.org/10.1093/procel/pwad013

 

文章来源于杏泽资本